东北大学Carol Livermore和哈佛医学院Y. Shrike Zhang 课题组: 基于折纸艺术的微流控器官芯片

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本文介绍了一种基于折纸的肝脏芯片的设计和制造，并展示了该芯片在重现肝脏的一些关键体内结构、物理微环境和功能方面的有效性。聚酰亚胺胶带的激光切割层与聚碳酸酯纳米多孔膜折叠在一起，形成三个相邻的流室，这些流室被纳米多孔膜分开。内皮细胞在上、下通道中，肝细胞在中层通道中共同模拟窦状流。营养物质和代谢物通过模拟的血液层流动，在血管通路和肝细胞层之间扩散，模拟了生理微循环。对药物化合物的细胞活力、代谢功能和肝毒性的研究表明，内皮化的肝脏芯片模型有助于维持肝细胞功能和评估药物的肝毒性。这种独特的基于折纸的方法加快了芯片的开发和优化，有效地简化了人体组织芯片模型制作，同时保留了其结构和功能的复杂性。 肝脏是最大的代谢器官，在糖原储存、脂质和血浆蛋白生物合成、胆汁酸分泌、药物解毒和内分泌信号传导等几个关键功能中起着重要作用。 肝细胞是肝脏的主要功能细胞，占肝脏体积的约80%，在肝功能中发挥着核心作用。密切模拟体内微环境的体外原代肝细胞培养方法为评价药物毒性和筛选治疗药物提供了一个潜力平台，从而提高了临床试验中药物发现的成功率。 近年来，微加工和微流控技术已被用于体外三维肝培养模型的药物代谢研究，包括原代肝细胞的单一培养或与非实质细胞共培养。这些三维肝脏培养模型包括肝球体微模式或生物打印肝脏构建物和肝脏芯片模型。这些模型可促进体内正常肝脏生理或病理生理条件的恢复以及药物反应的评估。微流体系统允许精确控制生理相关参数，例如流速、营养物质和氧气，而这些参数对于体外维持肝细胞功能至关重要。然而，无论是从功能还是制造角度来看，创建类似体内的肝脏芯片设备都是一个挑战。在三维结构中，传统的微流控芯片难以在 3D 架构中复制沿肝血窦的流动，与肝血窦和肝细胞之间的物种传输相结合（图 1a）。此外，肝脏芯片设备的制造通常需要专用的微制造设施（例如软光刻）和多步骤工艺来实现合适的组织芯片架构。  
图 1. a) 肝、肝小叶、肝窦三维结构。 b) oLOC 的概念示意图横截面，显示已折叠的半透膜，在相对两侧播种肝细胞和内皮细胞单层，并用顶板和底板盖住以形成上下流动通道（血管室）模拟血窦和一个中央静态室，而上下膜表面包含肝细胞培养。 c) 实现的 oLOC 示意图，显示膜层（黑色和白色斑点）、流动介质途径（红色）、静态介质途径（蓝色）、肝细胞（紫色）、内皮细胞（栗色），以及它如何模拟具有流动功能（红色箭头）和扩散转运功能（白色箭头）的肝脏结构。 基于折纸的设计和实施为功能化和制造中的挑战提供了一个潜在的解决方案。在传统的微流控芯片中，通常使用软光刻或其他技术创建单一基材（例如，聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 或热塑性塑料，如聚苯乙烯、聚碳酸酯、或聚（甲基丙烯酸甲酯））的微制造层，并以堆叠方式粘合在一起，形成一个流动通道网络。在基于折纸的方法中，多种基础材料的预制图案层可以沿着预定义的折叠线方便地折叠在一起，形成精准对齐的多材料堆叠，这些堆叠不仅可以形成一个流动通道网络，还可以形成结构，使功能超越简单的流动。 图1b和c显示了肝脏中两种核心运输模式沿窦状流的整合，以及窦状流和肝细胞层之间的运输整合到一个多材料芯片中，该芯片由两个聚碳酸酯纳米多孔膜层分隔的三个相邻折叠隔间组成（图1b）。最外面的两个流动通道是模拟血窦的血管腔。每个模拟的血窦在外边缘以实心通道壁为界，在内边缘以纳米多孔膜为界。中心通道是肝细胞室，由两个纳米多孔膜包围。两种纳米多孔膜都在窦侧植入单层内皮细胞（图 1c 中的红色显示）和肝细胞侧的肝细胞（图 1c 中的蓝色显示）。纳米孔膜及其内皮单层在某些方面类似于窦周间隙和天然肝组织中的内皮，允许模拟窦状细胞和肝细胞单层之间的扩散，同时防止直接流过肝细胞以保护它们免受剪切应力的影响。 模拟血窦和肝细胞层的入口、出口、流动连接、穿孔褶皱线和面内边界在聚酰亚胺带中形成。通过将纳米多孔膜和无孔聚酰亚胺薄膜折叠成一个多材料堆叠，这种折纸方法将细胞单层之间的流动通道和扩散界面整合到一个单一的、快速制造的设备中。肝功能就是在这种流动扩散结构中通过在窦状细胞和肝细胞腔之间的纳米孔膜的相对两侧播撒细胞单层来实现的。 因此，本研究的目的是证明一种基于折纸的肝脏芯片（oLOC）能够模拟一些关键的体内结构和物理微环境参数，以支持原代肝细胞在生理微循环条件下的培养。我们oLOC平台的一个重要特性是它采用了一个简单的制备策略，使介质能够通过靠近中央腔室中的原代肝细胞的上腔室和下腔室（模拟血窦）连续循环，以便为细胞微环境重新填充营养物质，同时带走废物。通过实现两种关键细胞类型之间的化学相互作用，本研究强调我们这里描述的内皮化肝脏模型有利于维持细胞活力和一些关键的肝细胞功能，并证明了其在评估药物化合物的肝毒性方面的潜在适用性。结果有效地展示了我们独特的折纸方法在未来快速生成结构和功能相关的芯片器官模型中的可能效用。尽管使用传统方法也可以达到类似的芯片复杂性水平，但传统的制造方法通常比目前的折纸方法更复杂。 实验结果表明，基于折纸的肝脏芯片设计和制造方法可以通过减少制备过程的复杂度（例如，复制沿血窦的流动以及血窦和肝细胞之间的转运），成功地重现足够水平的架构复杂性 （例如，需要在专用微细加工设施中进行多步工艺）。oLOC设备由预制芯片板制成，通过穿孔折叠接头连接，并紧凑地存放在实验室中。穿孔折叠接头的受约束运动学确保了手动折叠过程后各层的正确对齐。虽然材料是预先设计好的，但折纸平台的灵活性使设备能够快速定制，只需改变折叠顺序，最终产生出成功的第 3 代 oLOC 设备。 第3代芯片在模拟天然肝组织结构和功能的内皮化oLOC系统中表现出原代人肝细胞和HUVEC在均匀分布层中的高活性。尿素和白蛋白的合成，以及代谢酶的表现，表明肝细胞在oLOC环境中保留了相当高程度的分化功能。在 oLOC 中使用对乙酰氨基酚和他莫昔芬对原代肝细胞和 内皮细胞进行的毒性测试再现了肝毒性，表明 oLOC 可能支持急性肝毒性评估。这些结果为未来基于折纸的制造、优化和药物筛选的实际应用提供了潜在的机会，不仅可以用于芯片肝脏设备，还用于其他折纸化器官芯片或多器官芯片系统。  
图 2. a) 激光图案化聚酰亚胺胶带和与其交叉折叠的纳米多孔膜的示意图。b) oLOC（灰色、红色、深蓝色和黄色）及其顶部和底部丙烯酸盖板（浅蓝色）的折叠结构的分解示意图。c) 完成的oLOC芯片示意图和 d) 完成的 oLOC 的横截面剖视图。e-j) 第 3 代oLOC芯片设备的制造过程照片，包括 (e) 打孔和修整以制备纳米多孔膜图形，(f) 在腔室面板之间折叠纳米多孔膜以形成折纸子单元，(g) 分层流动面板形成额外的子单元，(h) 将折纸子单元堆叠在固体丙烯酸基板的顶部以形成设备的流动结构，(i) 用丙烯酸顶板盖住堆栈（带有四个流体入口/出口）和将 PVC 管粘附到端口中，以及 (j) 组装后的最终第 3 代设备结构。k) 第 3 代设备的流动模式，黄色染料流经上下通道，蓝色染料流经中层通道。l) 当 0.1% 的台盼蓝去离子水溶液流过芯片的上下通道并流过去离子水时，从中间通道流出的台盼蓝浓度与逆流速的关系图。  
图 3. a) 在培养第 7 天使用钙黄绿素 AM（绿色）和 EthD-1（红色）染色评估的原代肝细胞和 HUVEC 的生存能力。b) 不同培养时期原代肝细胞和内皮细胞的定量代谢活动。c) 在培养第 7 天，原代肝细胞和内皮细胞的 F-肌动蛋白和细胞核染色。d) 在培养第 7 天对原代肝细胞的 CYP3A 和内皮细胞的 CD31 和 VE-钙粘蛋白的免疫染色。  
图 4. a) 对乙酰氨基酚处理 48 小时后，使用钙黄绿素 AM（绿色）和 EthD-1（红色）染色通过细胞活力测定显示对乙酰氨基酚对原代肝细胞的细胞毒性。b) 在不同浓度的对乙酰氨基酚下量化肝细胞的细胞代谢活性。c) 在不同浓度的对乙酰氨基酚下，肝细胞 48 小时尿素产量的量化。d) 在不同浓度的对乙酰氨基酚下，肝细胞产生的 48 小时白蛋白定量。星号代表动态培养组和静态培养组之间使用双向方差分析的显着差异 (p ≤ 0.05)。  
图 5. a) 他莫昔芬处理 48 小时后，使用钙黄绿素 AM（绿色）和 EthD-1（红色）染色通过细胞活力测定显示他莫昔芬对 HepG2 细胞的细胞毒性。b) 在不同浓度的他莫昔芬下量化 HepG2 细胞的细胞代谢活性。c) 在不同浓度的他莫昔芬下，HepG2 细胞的定量 48 小时尿素产量。d) 在不同浓度的他莫昔芬下，HepG2 细胞产生的 48 小时白蛋白定量。星号代表动态培养组和静态培养组之间使用双向方差分析的显着差异 (p ≤ 0.05)。 该文章以“Customizable Microfluidic Origami Liver-on-a-Chip (oLOC)” 为题发表在《先进材料技术》（Advanced Materials Technologies）上。哈佛大学医学院博士后谢鑫（现于TransMedics公司任职生物医学工程与系统工程高级工程师与项目经理），哈佛大学医学院博士后Sushila Maharjan为论文的共同第一作者。美国东北大学Carol Livermore教授与哈佛大学医学院Y. Shrike Zhang教授为论文共同通讯作者。

原文链接

Xin Xie, Sushila Maharjan, Chastity Kelly, Tian Liu, Robert J. Lang, Roger Alperin, Shikha Sebastian, Diana Bonilla, Sakura Gandolfo, Yasmine Boukataya, Seyed Mohammad Siadat, Yu Shrike Zhang,* and Carol Livermore*

https://doi.org/10.1002/admt.202100677

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